Controle Interno da Qualidade para Testes de Sensibilidade a antimicrobianos Projeto de “Monitoramento e Prevenção da Resistência Microbiana em Serviços de Saúde”
Provida Provendo Soluções Preservando Vidas. Nanoclean Eficiente
Contra Bactérias, Vírus e Fungos. Prevenção deveria ser Obrigação!
O programa de controle interno da qualidade é um conjunto de ações
que visam garantir a qualidade e reprodutibilidade dos processos e dos
resultados produzidos por meio da verificação continua dos fatores que
interferem nessa. Deve ser visto como uma oportunidade de
aprimoramento das atividades desenvolvidas no laboratório. Segundo a
Organização Mundial de Saúde (OMS)1 a implantação de um programa da
qualidade é necessária para:
•melhorar a qualidade dos serviços de saúde;
•gerar resultados confiáveis e reproduzíveis;
•propiciar que resultados interlaboratoriais sejam comparáveis;
•aumentar a credibilidade do laboratório entre os médicos e seus clientes;
•motivar os funcionários a melhorar o desempenho; e
•prevenir de complicações legais que podem seguir a liberação de exames de baixa qualidade.
Muitos fatores interferem na qualidade dos resultados liberados pelo
laboratório de microbiologia, como por exemplo: (a) a seleção, coleta,
transporte e acondicionamento apropriados do espécime biológico; (b) o
treinamento, comprometimento e motivação do pessoal de laboratório; (c)
fatores ambientais, como luminosidade deficiente ou excessiva,
ventilação e condições do local de trabalho;
fatores analíticos, como baixa qualidade dos reagentes, vidraria,
corantes, meios de cultura e falta de equipamentos precisos; e (e) erros
de transcrição de resultados, resultados liberados incompletos e
interpretação errada das provas bioquímicas ou antibiograma1.
Este guia é um instrumento que tem como objetivo oferecer subsídios
aos laboratórios de microbiologia na elaboração do manual de
procedimentos operacionais padrão (POP) que deve ser construído pelo
laboratório. Ele faz parte do Manual de Microbiologia Clínica para o
controle de infecção em serviços
de saúde elaborado e disponível na página eletrônica da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) 2. Este deve ser utilizado em
consonância com a Clinical and Laboratory Standard Institute
(CLSI), Boas Práticas de Laboratórios, Norma Brasileira Reguladora -NBR
ISO/ IEC 17025 por microbiológicos
e biológicos e Resolução Diretoria Colegiada -RDC 302, de 13 de outubro de 2005.
Os documentos aqui apresentados contêm informações básicas acerca da
realização, da freqüência e das indicações dos testes de controle
interno da qualidade (CIQ) dos laboratórios de microbiologia clínica, na
fase analítica.
1. ParâMeTroS Para uM PrograMa de CoNTroLe da QuaLIdade2,3
I -FaSe Pré-aNaLíTICa
a) garantia da qualidade das amostras clínicas
O laboratório de Microbiologia deve elaborar um manual de instruções, contemplando os seguintes itens:
•coleta, identificação e conservação da amostra;
• transporte da amostra, estabelecendo meio recomendado, prazo,
condições de temperatura e padrão técnico para garantir a sua
integridade e estabilidade;
. critérios para o preparo do cliente com instruções claras e
escritas em linguagem acessível, sendo que somente as instruções simples
e de fácil compreensão podem ser dadas verbalmente;
•critérios para a aceitação ou rejeição das amostras; e
• documentação das informações relacionadas às amostras coletadas,
como data, horário e responsável pela coleta e eventuais
intercorrências, garantindo sua rastreabilidade durante todo o processo.
II -FaSe aNaLíTICa
a) Manual de Procedimentos operacionais Padrão (PoP)
O laboratório de Microbiologia deve elaborar os documentos internos
de procedimentos, seguindo as indicações de GP2-A4 do CLSI (Clinical
Laboratory Technical Procedure Manuals; Approved Guideline - Fourth
Edition (2002) e deste documento.
•OsPOP´sdeverãoconter,nomínimo:técnica,limitesdetolerância,aceitaçãoerejeiçãodaamostra, preparo
de reagentes, controle de qualidade (CQ), cálculos, critérios de
liberação de resultados.
•Revisar os documentos, anualmente, ou sempre que ocorrer mudanças nos processos descritos.
•Disponibilizar as informações escritas no ambiente de trabalho.
B) garantia da qualidade técnica dos colaboradores
•Oferecer e documentar capacitação técnica para as atividades desempenhadas na rotina do laboratório de microbiologia.
•Manter programa de capacitação para o uso apropriado de equipamentos.
•Utilizar equipamentos de proteção individual (EPI) e equipamentos de
proteção coletiva (EPC) e cumprir as normas de biossegurança.
•Participar ativamente junto à Comissão de Controle de Infecção
Hospitalar (CCIH), fornecendo dados epidemiológicos de diferentes
agentes etiológicos de infecção hospitalar e seus perfis de
sensibilidade.
•Armazenar cepas de interesse para estudos.
•Os resultados dos procedimentos e testes devem ser conferidos quanto
à exatidão, reprodutibilidade e concordância com os padrões de CQ pelo
responsável designado.
C) desempenho dos equipamentos e instrumentos
•Elaborar e manter um programa de manutenção preventiva e corretiva dos equipamentos.
•Manter registro diário de temperaturas dos equipamentos de banho-maria, estufa, freezer, geladeira e meio ambiente.
•Fazer controle da eficácia do processo de esterilização das autoclaves (Bacillus stearothermophilus).
•Dispor de manual de funcionamento do equipamento em português.
•Estabelecer cronograma de manutenção preventiva.
•Registrar a manutenção preventiva e corretiva dos equipamentos em uso.
•Documentar o estado de calibração dos equipamentos e instrumentos
usados nos processos analíticos, como pipetas automáticas e pipetadores,
termômetros, centrífugas, microscópios, espectrofotômetros,
turbidímetro, balanças analíticas, pHmetro, equipamentos analíticos,
etc.
•Documentar a verificação do funcionamento do equipamento.
•Documentar a realização da limpeza dos equipamentos.
•Manter e documentar a higienização periódica de fluxos, cabines de
segurança, capelas, geladeiras, freezer, banho-maria, centrífugas,
estufas, etc.
Aumentar a utilização de cepas de referência para o CIQ de acordo com as especificações do equipamento.
•Documentar alertas emitidos pelo equipamento.
•Atualizaa software a cada mudança, documentando as modificações.
• Definir os limites de aceitabilidade para as inexatidões
encontradas nas calibrações, verificações e comparações entre
equipamentos, e garantir a implementação de ações corretivas para os
eventuais desvios.
d) Controle da Qualidade dos Insumos Laboratoriais (CQIL)
D1. Corantes e reagentes
•Respeitar as orientações escritas dos fabricantes para o uso dos reagentes.
•Solicitar cópia dos laudos qualitativos junto ao fabricante para cada lote recebido.
•Rotular cada produto com: nome, número do lote, concentração, condições de estocagem,
data do preparo, recebimento, quando foi colocado em uso e prazo de validade.
•Testar com controles positivos e negativos antes do uso, conforme o tipo de teste.
•Se os resultados não forem satisfatórios notificar o fornecedor e o SNVS.
• Descartar o produto se o controle não estiver apropriado.
• Definir e documentar o grau de pureza da água reagente utilizada
nas análises, assim como a forma de obtenção e controle dessa água.
D2. Meios de cultura
•Documentar a quantidade de meio preparado no laboratório, número do
lote, método de esterilização, data do preparo, pH, validade e técnico
responsável pela preparação.
•Realizar e documentar teste de esterilidade e desempenho dos meios
preparados no laboratório, utilizando cepas de referência, tipo ATCC.
•Observar o meio quanto a cor, consistência, profundidade e/ou superfície, hemólise, presença de bolhas e contaminação.
•Documentar o número do lote e a data de recebimento dos meios
comerciais. Solicitar ao fornecedor o ertificado de controle de
qualidade, conforme recomendações do CLSI.
• Documentar os meios que não estejam de acordo com os padrões, as
ações corretivas tomadas e informar ao fornecedor e ao SNVS. D3. Discos e
fitas E-test
• Testar os discos ou fitas E-test de antimicrobianos, cartões ou
painéis com antibióticos, diariamente, por 20 dias consecutivos, a fim
de validar a metodologia. Utilizar cepas de referência, tipo ATCC.
• Seguir, rigorosamente, as recomendações do fabricante quanto ao armazenamento dos discos antimicrobianos.
• Documentar os discos de antimicrobianos que não estejam de acordo
com os padrões CLSI, as ações corretivas tomadas e informar ao
fornecedor e SNVS.
D4. Kits comerciais e anti-soros
•Verificar se há registro do kit junto ao ministério da saúde www.anvisa.gov.br
• Testar os kits e anti-soros de um novo lote em paralelo com o lote
anterior ou com cepas de referência, antes de colocá-los em uso.
Utilizar controles positivos e negativos, juntamente com cepas de
referência recomendadas. Documentar os resultados desses testes.
•Seguir as recomendações do fabricante para o teste do controle da qualidade.
•Registrar as informações contidas no rótulo do Kit para rastreabilidade do processo.
•Notificar ao fornecedor e SNVS os desvios de qualidade encontrados. III -FaSe PóS-aNaLíTICa
• Documentar a liberação de resultados, emissão e entrega de laudos.
•Garantir a confidencialidade dos resultados dos laudos.
• Fornecer aos colaboradores uma avaliação periódica de desempenho do
laboratório no controle interno, verificando a abrangência e adequação
desses controles.
2. CePaS de reFerêNCIa6,7
2.1. deFINIçõeS6
As cepas de referência destinam-se à verificação dos resultados
obtidos, pois suas características fenotípicas já são conhecidas, ou
seja, sua identificação e seu perfilde sensibilidade já foram
determinados.
As cepas de referência devem possuir uma origem confiável, vindo de
um laboratório de referência que realiza testes fenotípicos e
moleculares para confirmar sua identificação e perfil de sensibilidade.
Define-se como cultura de estoque o subcultivo das cepas de
referência. Essa cultura é armazenada no laboratório de microbiologia (a
-20oC ou menos) e é descongelada anualmente.
A cultura de trabalho é o subcultivo semanal ou mensal da cultura de
estoque e será mantida no laboratório (4oC a 8oC) para realização dos
testes diários ou semanais de CIQ.
Uma passagem é a transferência do organismo de uma cultura viável
para um novo meio de cultura com crescimento de microrganismos. A
hidratação (ou decongelamento) de uma cepa de referência não é
considerada uma passagem ou repique. A primeira passagem será o
subcultivo da cepa de referência para a cultura de estoque. A
transferência do microrganismo da cultura de estoque para a cultura de
trabalho será a segunda passagem (Figura 1).
Figura 1. ProPagação da CuLTura de BaCTérIaS4
Cepa de referência Cultura de estoque Cultura de trabalho
1ª passagem 2ª passagem
Implantação da Rede Nacional de Monitoramento da Resistência Microbiana em Serviços de Saúde
Microrganismos
Gram-negativos
2.2. Tabela 1: INdICação de uSo daS CePaS de reFerêNCIa4,5
Teste indicado
E. coli ATCC 25922
-Cepa não produtora de ß-lactamase. E. coli ATCC 35218
- Cepa produtora de ß-lactamase
• Qualidade da prova de DD e CIM para de
ß-lactâmicos e inibidores de ß-lactamase
• Qualidade da prova de DD e CIM para Amoxacilina
-Ac. clavulânico de Haemophilus spp
• VITEK GNS MIC painel QC set
Deve ser mantida a -60oC para prevenir perda do plasmídeo
• Testes automatizados para inibidores de
ß-lactamase em painéis de gram-negativos
E. coli ATCC 51446 • Testes automatizados de para ESBL
K. pneumoniae ATCC 13883 • Qualidade da prova em testes automatizados de
identificação de bacilos gram-negativos
K. pneumoniae ATCC 700603
-Cepa produtora de ß-lactamase de espectro ampliado
Deve ser mantida a -60oC para prevenir perda do plasmídeo
P. aeruginosa ATCC 27853
Sensível aos agentes anti-pseudomas
• Qualidade da prova de DD e CIM de enterobactérias
• Qualidade da prova de DD e CIM de Pseudomonas, Acinetobacter, S. maltophilia e
Burkholderia
• Qualidade da prova de DD e CIM de Vibrio colerae
• Testes de triagem e confirmatório de ESBL
• Qualidade da prova em testes automatizados de susceptibilidade em painéis de gram negativos
• Testes de triagem e teste confirmatório de ESBL
• Qualidade da prova em testes de diluição em caldo e diluição em ágar de P. aeruginosa e outros não-enterobacteriaceas
• Testes automatizados para verificação da concentração de cátion e
pH com aminoglicosídeos em painéis de gram-negativos P. mirabilis ATCC
7002
• Qualidade da prova em testes automatizados de identificação de bacilos gram-negativos
Microrganismos Gram-positivos
2.2. Tabela 1: INdICação de uSo daS CePaS de reFerêNCIa4,5
Teste indicado
E. faecalis ATCC 29212
-Sensível a vancomicina, ampicilina e altos níveis de aminoglicosídeos
• Adequação do meio para testes de sulfonamidas e trimetropim, DD e CIM
• Qualidade da prova de CIM para Enterococcus spp
• Teste de triagem de alto nível de resistência aos aminoglicosídeos e à vancomicina
• Qualidade da prova em testes automatizados de identificação e susceptibilidade de gram-positivos
E. faecalis ATCC 51299
- Resistente a vancomicina e altos níveis de aminoglicosídeos
• Teste de triagem de alto nível de resistência aos aminoglicosídeos e à vancomicina
• Testes automatizados de susceptibilidade a vancomicina para gram-positivos S. aureus ATCC 25923
-Cepa não produtora de ß-lactamase
• Qualidade da prova em testes de DD para Staphylococcus spp, Enterococcus spp
S. aureus ATCC 29213
- Cepa produtora de ß-lactamase
• Qualidade da prova em testes de CIM para
Staphylococcus spp
•Teste confirmatório de susceptibilidade a Oxacilina
• Qualidade da prova em testes automatizados de identificação susceptibilidade de gram-positivos
S. aureus ATCC 43300
- Resistente a oxacilina
• Teste confirmatório de susceptibilidade a Oxacilina
S. pneumoniae ATCC 49619 • Qualidade da prova de DD da susceptibilidade de S.
- Intermediário para penicilina pneumoniae ou Streptococcus spp
Leveduras
C. albicans ATCC 14053 • Qualidade da prova em testes automatizados de identificação de leveduras
C. parapsilosis ATCC 22019 • Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por CIM e DD de fluconazol
C. kruzei ATCC 6258 • Qualidade da prova em testes de
susceptibilidade por CIM de leveduras C. albicans ATCC 90028 • Qualidade
da prova em testes de susceptibilidade por DD de fluconazol
C. tropicalis ATCC 750 • Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por DD de fluconazol
Capítulo 1
Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Bacteriologia
1. CePaS de reFerêNCIa
1.1. MaNuSeIo e eSToCageM
As cepas de referência têm um número máximo de gerações a qual podem
ser submetida, são cinco passagens a partir da cepa de referência
original6.
O número indefinido de passagens pode comprometer principalmente a
pureza da cultura e as características fenotípicas de algumas bactérias.
Seguindo os procedimentos descritos neste documento e em condições
ideais de armazenagem, a passagem para a produção das culturas de
estoque pode ser anual e a passagem das culturas de trabalho pode ser
realizada a cada três semanas.
Algumas cepas devem ser mantidas em condições especiais devido a suas características intrínsecas
(ex. cepas exigentes).
• As cepas de controle da qualidade devem ser testadas usando os
mesmos materiais e métodos empregados para testes de isolados clínicos.
•No caso de armazenamento prolongado, as culturas de referência devem
ser mantidas a temperatura de -20oC, ou menos, (de preferência a -60oC
ou menos, ou em nitrogênio líquido) em meio estabilizador recomendado.
• Meios utilizados para a manutenção das cepas de referência (Figura
2): . Skin milk a 20% (p/v) de leite desnatado em pó dissolvido em água
destilada, autoclavar a 121oC por 20 minutos.
. Caldo de soja tríptica a 10 - 20% de glicerol (v/v), autoclavar 121oC por 20 minutos.
. Sangue de coelho desfibrinado.
• OBS: Os criotubos com selo de proteção interna são os mais
utilizados para o processo de armazenamento dessas amostras. Os
criotubos são preparados com antecedência, em volumes que em geral estão
em torno de 0,5mL por tubo, e previamente testados quanto à
esterilidade.
A)Partindo da cepa original liofilizada:
• Ressuspender a cepa liofilizada, conforme as recomendações do fabricante.
• Homogenizar o frasco. • Semear em meio de cultura específico (Ágar Sangue, MacConkey ou Ágar Chocolate).
• Fazer dois repiques.
• Identificar através de provas bioquímicas manuais ou automatizadas e coloração de Gram.
• Realizar testes de sensibilidade antimicrobianos.
• Depois de certificar a identificação e os testes de sensibilidade, armazenar a cepa.
• Transferir as colônias recentes de 18 a 24 horas, em 15 frascos
estéreis (criotubos), para cada cepa de referência a ser utilizada no
controle.
• Etiquetar os frascos com o nome do microrganismo, número da cepa de
referência, a data do armazenamento e o mês a ser utilizado (janeiro a
dezembro). Nos outros três frascos, colocar a data dos três anos
seguintes para realizar o mesmo procedimento.
• Armazenar em freezer –20oC ou – 60oC (Figura 2).
B) Partindo da cepa congelada:
• Retirar o criotubo com a cepa (ex.: janeiro) do freezer e com o
auxílio de uma alça bacteriológica, semear a amostra ainda congelada em
meio específico.
•Incubar a placa por 18 a 24 horas em temperatura e atmosfera recomendadas.
•Fazer um segundo repique utilizando duas placas.
•Numa das placas, fazer os testes de sensibilidade a antimicrobianos (para a 1ª semana).
•Na outra placa, semear a cepa em três tubos de Ágar Müeller Hinton inclinado.
•Incubar por 18 a 20 horas em temperatura e atmosfera recomendadas.
•Colocar esses tubos na geladeira ( 2 a 8oC) para serem utilizados
nos testes de sensibilidade aos antimicrobianos para a 2a, 3a e 4a
semanas do mês, repicar apenas uma vez.
•Esse procedimento deve ser realizado para todas as cepas envolvidas no CIQ (Figura 3).
•OBS: As culturas congeladas ou liofilizadas devem ser cultivadas duas vezes antes de se realizar os testes de sensibilidade.
• Atenção especial à manutenção do organismo (subcultivo mínimo) e
seu armazenamento (ex.-60oC ou menos) são particularmente importantes
para as cepas CIQ E. coli ATCC 35218 e K. pneumoniae ATCC 700603, visto
que tem sido documentada a perda espontânea do plasmídeo que codifica a
ß-lactamase.
• Deve-se preparar um novo lote de cultivos se forem obtidos resultados aberrantes.
Geladeira
Para padronizar a densidade do inóculo para um teste de
sensibilidade, deve-se usar um controle de turbidez de BaSO4,
equivalente a uma solução padrão 0,5 de McFarland ou seu
equivalente óptico (ex., suspensão de partículas de látex). A solução
padrão 0,5 de McFarland de BaSO4 pode ser preparada da seguinte maneira.
•Acrescenta-se uma alíquota de 0,5mL de BaCl2 0.048 mol/L (1,175% v/v
BaCl2 • 2H2O) a 99,5mL de H2SO4 0,18mol/L (1% v/v), homogeneizando
constantemente para manter a suspensão.
•A densidade correta do controle de turbidez deve ser verificada
usando um espectrofotômetro com fonte de luz de 1-cm e cubeta apropriada
para determinar a absorbância. A absorbância da solução padrão 0,5 de
McFarland deverá variar de 0,08 a 0,10 utilizando um comprimento de onda
de 625 nm.
•A suspensão de sulfato de bário deve ser transferida, em alíquotas
de 4 a 6 mL, para tubos com tampas de rosca do mesmo tamanho usados para
cultivar e diluir o inóculo bacteriano.
•Esses tubos devem ser selados hermeticamente e armazenados em local escuro, à temperatura ambiente.
•O controle de turbidez de sulfato de bário deve ser agitado
vigorosamente num misturador mecânico tipo vórtex antes de cada uso,
verificando se está uniformemente túrbido.
No caso de precipitação visível, o controle deve ser substituído. As
suspensões de partículas de látex devem ser misturadas invertendo-as
suavemente, e não num misturador tipo vórtex.
•Os controles de sulfato de bário devem ser substituídos, ou suas densidades verificadas, todo mês.
3. MéTodo de dISCo-dIFuSão
O método de Kirby-Bauer ou disco-difusão é recomendado para algumas
combinações microrganismo/antimicrobiano e é muito utilizado em nosso
meio. Sua praticidade, baixo custo e facilidade operacional facilitam a
implantação deste método nos laboratórios de microbiologia clínica.
Alguns fatores relacionados ao preparo do meio de cultura e sua
composição podem interferir no resultado final liberado pelo
laboratório. A confirmação da qualidade, esterilidade e composição do
meio de cultura devem ser avaliadas através dos testes de CIQ.
3.1. FreQüêNCIa doS TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade
A freqüência dos testes de CIQ deve ser no mínimo mensal. Entretanto,
as recomendações nacionais e internacionais2,6 preconizam testes
semanais. Essas recomendações devem ser seguidas se a estrutura ou a
capacidade do laboratório permitir.
A introdução do programa de CIQ inicia-se com a realização de testes
diários, passando, em fase posterior, para a realização mensal dos
testes.
•Teste diário -Testar todas as cepas de controle pertinentes durante cinco dias consecutivos e documentar os resultados.
•Para passar a realização dos testes de diária para mensal nenhuma
das cinco leituras de halos, para cada combinação de
agente/antimicrobiano, pode estar fora dos limites aceitáveis.
Implantação da Rede Nacional de Monitoramento da Resistência Microbiana em Serviços de Saúde
•Teste mensal - Testar todas as cepas de CIQ no mínimo mensalmente e
sempre que qualquer novo reagente do teste for utilizado (ex.: um novo
lote de ágar ou meio, um novo lote de discos ou outro fabricante de
insumos).
•Documentar a realização dos testes de controle da qualidade,
anotando os números dos lotes, meios de cultura, reagentes, discos de
antibióticos testados nas respectivas datas e mês.
•Sempre que algum resultado dos testes mensal de controle da
qualidade estiver fora da faixa aceitável, faz-se necessário implantar
ação corretiva6.
•Sempre que um novo agente antimicrobiano for acrescentado ou houver
mudanças importantes no método de leitura dos resultados dos testes,
estes devem ser realizados por cinco dias consecutivos e documentados,
antes de se passar para uma freqüência mensal.
3.2. TeSTe de CoNTroLe da QuaLIdade doS MeIoS de CuLTura6
a) Meio de cultura O meio indicado para os testes de disco-difusão em organismos não fastidiosos é o Ágar Müeller-Hinton (MH).
B)espessura
A espessura do meio deve ser de 4 mm uniformemente distribuída. Volumes médios utilizados:
60 a 70 mL / placa de 150 mm e 25 mL / placa de 90 mm.
C) esterilidade
• Após preparo das placas, examinar uma amostra significativa (10%) e
aleatória de cada lote das placas para confirmar sua esterilidade,
mediante sua incubação a 30°C
-35°C por, pelo menos, 24 horas.
• As placas devem ser usadas até sete dias após o preparo, a não ser
que sejam tomadas precauções adequadas, como embrulhá-las em saco
plástico, para minimizar o ressecamento do ágar.
d) pH
• O pH de cada lote de Ágar Müeller-Hinton deve ser verificado quando
o ágar é preparado. O meio ágar deverá ter pH entre 7,2 e 7,4 a
temperatura ambiente após solidificação.
• A medida do pH deve ser feita preferencialmente através de pHmetro
apropriado, submerso em porção de meio solidificado à temperatura
ambiente. Caso esteja fora das especificações, deve-se checar a
procedência do meio, a qualidade da água e, eventualmente, preparar
novo lote seguindo estritamente as recomendações do fabricante6.
• Métodos de verificação de pH (ver CLSI Norma M2-A96 ou norma substituta):
. Macerar uma quantidade suficiente de ágar para submergir a ponta de um eletrodo do pHmetro calibrado.
. Ou permitir que uma pequena quantidade de ágar solidifique-se em torno da ponta de um eletrodo do pHmetro calibrado.
.Ou em um béquer contendo o ágar usar um eletrodo de superfície devidamente calibrado.
e)efeitos da timidina ou timina
•Excesso dessas substâncias pode levar a falsas resistências para
sulfa-trimetoprim. Portanto, deve-se usar meio Ágar Müeller-Hinton com o
menor teor possível de timina ou timidina
Tecnologia em Serviços de Saúde
•O teor de timidina ou timina deve ser testado com Enterococcus
faecalis ATCC 29212 com discos de sulfametaxol/trimetoprim. Um meio
satisfatório produzirá halos de inibição nítidos com diâmetro = 20 mm.
F) Defeitos de Variação nos Cátions divalentes
• As variações nos cátions divalentes, principalmente magnésio e
cálcio, afetarão os resultados dos testes dos aminoglicosídeos e da
tetraciclina e variação nos níveis de cálcio também afeta os resultados
dos testes de daptomicina. Realizar teste de qualidade da prova
para estes agentes antimicrobianos.
G) Armazenamento de Discos Antimicrobianos Os discos devem ser armazenados conforme indicado a seguir.
•Refrigerar os recipientes a temperatura de 8°C ou menos, ou congelar
a -15°C ou mais frio, num congelador comum (não do tipo “frost-free”)
até o momento de usar.
•Os pacotes fechados de discos contendo drogas da classe de
ß-lactâmicos devem ser armazenados congelados, com exceção de um pequeno
número de discos reservados para o trabalho cotidiano, que pode ser
refrigerado (entre +4oC e +8oC) durante, no máximo, uma semana.
•Alguns agentes lábeis (ex., combinações de ácido clavulânico,
carbapenêmicos e cefaclor) devem ser armazenados congelados até o uso.
•Os recipientes fechados de discos devem ser retirados da geladeira
ou congelador uma ou duas horas antes de serem usados, para que se
equilibrem em temperatura ambiente antes de serem abertos.
•Após retirar o cartucho de discos do pacote selado, colocá-lo num dissecador.
•Quando se usa um dissecador, este deve ser tampado hermeticamente,
acrescentando-se um dissecante recomendado. Deve-se deixar que a
temperatura do dispensador chegue à temperatura ambiente antes de
abri-lo. Evitar umidade excessiva, substituindo o dissecante sempre que o
indicador mudar de cor.
•Quando não estiver em uso, o dispensador de discos deve ser mantido refrigerado.
•Apenas os discos dentro do prazo de validade do fabricante podem ser usados. Os discos devem ser descartados no vencimento.
3.3. TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade da ProVa e do PerFIL de SeNSIBILIdade
Falhas na detecção do padrão de resistência podem estar relacionadas a diversos fatores como:
má qualidade do meio de cultura, disco com baixa concentração de
antimicrobiano, falhas no procedimento, inóculo com concentração de
microrganismos fora do preconizado, tempo e temperatura de incubação
inapropriados.
O controle da acurácia dos testes realizados deve ser feito
utilizando-se as cepas referência para o gênero ou espécie do
microrganismo ou classe de antimicrobiano que está sendo testado.
Serão testados os antimicrobianos que fazem parte do antibiograma
utilizado na rotina do laboratório. Ex. Se o laboratório testa para
Enterococcus spp ampicilina, ciprofloxacina, clorafenicol, teicoplanina,
vancomicina, quinupristin/dalfopristin, estes mesmos antimicrobianos
serão testados com a cepa referência S. aureus ATCC 25923 (ver abaixo)
para avaliar a qualidade da prova realizada, e os halos encontrados
serão comparados com os valores de referência7.
Os limites aceitáveis para os halos encontrados para as cepas de
referências e os diversos antimicrobianos são descritos em CLSI norma
M100-S167 ou norma substituta.
a) Condições dos testes de controle da qualidade e cepas de
referência usadas para monitorar a acurácia dos testes de disco difusão
enterobactérias
•Meio: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0,5 de McFarland
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas
•Cepas referência: E. coli ATCC 25922 e E. coli ATCC 35218 (para
combinações ß-lactâmicos/ inibidor de ß-lactamase) Detecção de eSbl em
K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli e P. mirabilis
Testes de triagem e confirmatório de ESBL
•Meio: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas
•Cepas de referência: E. coli ATCC 25922 e K. pneumoniae ATCC 700603 P. aeruginosa
•Meio: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas
•Cepas de referência: P. aeruginosa ATCC 27853 e E. coli ATCC 25922
e/ou E. coli ATCC 35218 (para combinações ß-lactâmicos/inibidor de
ß-lactamase)
Acinetobacter spp, S. maltophilia e B. cepacia
•Meio: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 20 a 24 horas
•Cepas de referência: P.aeruginosa ATCC 27853 e E. coli ATCC 25922
e/ou E. coli ATCC 35218 (para combinações ß-lactâmicos/inibidor de
ß-lactamase)
Staphylococcus spp
•Meio: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão de 0,5 de McFarland.
•Incubação: 33 a 35oC, ar ambiente, de 16 a 18 horas; 24 horas para
oxacilina, cefoxitina, meticilina, nafcilina e vancomicina. Tecnologia
em Serviços de Saúde
•Cepas de referência: S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 35218 (para
combinações ß-lactâmicos/ inibidor de ß-lactamase), S. aureus ATCC
BAA-977 e/ou BAA-976 (teste de indução à clindamicina)
.Enterococcus spp Meio: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas; 24 horas para vancomicina.
•Cepas de referência: S. aureus ATCC 25923; E. faecalis ATCC 29212
para os testes de detecção de resistência a altos níveis de
aminoglicosídeos. S. pneumoniae ou Streptococcus spp
• Meio: Ágar Müeller-Hinton com 5% de sangue de carneiro
• Inóculo: Método de suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0,5 de McFarland.
• Incubação: 35oC± 2 graus, CO2 a 5%, de 20 a 24 horas.
• Cepas de referência: S. pneumoniae ATCC 49619 Haemophilus influenzae e H. parainfluenzae
• Meio: Haemophilus Test Medium ( HTM ) – ver CLSI Norma M2-A9
• Inóculo: Método de suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0,5 de McFarland
• Incubação: 35oC± 2 graus, CO2 a 5%, de 16 a 18 horas.
• Cepa de Referência: H. influenzae ATCC 49247, H. influenzae ATCC
49766, E. coli ATCC 35218 (quando testar amoxacilina - ácido
clavulânico).
4. MéTodo de dILuIção eM CaLdo ou Ágar (CIM)
Os testes de diluição em caldo ou em ágar são utilizados para a
determinação da sensibilidade in vitro de um microrganismo a um agente
antimicrobiano. Por este método se determina a concentração inibitória
mínima (CIM) de um antimicrobiano, ou seja, a menor concentração de
antimicrobiano que inibe o cresciento de um microrganismo. Esse método é
também utilizado na confirmação de alguns perfis de resistência
detectados inicialmente por disco-difusão.
Falhas na detecção do padrão de resistência pelos métodos dilucionais
podem estar relacionadas a diversos fatores, como: má qualidade do meio
de cultura, concentração de cátions ou pH fora da faixa recomendada,
baixa concentração de antimicrobiano, solução estoque de antibiótico com
concentração
fora do preconizado, falhas no procedimento técnico, inóculo com
concentração de microrganismos fora do preconizado, tempo e temperatura
de incubação não recomendadas.
Os testes de CIQ avaliam os parâmetros críticos para a detecção da
resistência. E devem ser realizados nas mesmas condições e pelo mesmo
pessoal técnico que realiza os testes de rotina.
A freqüência dos testes de CIQ deve ser no mínimo mensal. Entretanto,
as recomendações nacionais e internacionais2,6 preconizam testes
semanais. Essas recomendações devem ser seguidas se a estrutura ou a
capacidade do laboratório permitirem.
A introdução do programa de CIQ inicia-se com a realização de testes
diários, passando, em fase posterior, para a realização mensal dos
testes.
• Teste diário – Testar todas as cepas de controle pertinentes durante cinco dias consecutivos e documentar os resultados.
• Para passar os testes de diários para mensais nenhuma das cinco
leituras de CIM para cada combinação de microrganismo/antimicrobiano
pode estar fora dos limites aceitáveis.
• Teste mensal – Testar todas as cepas de controle no mínimo
mensalmente e sempre que qualquer reagente do teste for utilizado (ex.
um novo lote de ágar ou meio, um novo lote de antimicrobianos ou outro
fabricante de insumos).
• Sempre que algum resultado dos testes mensais de controle de
qualidade estiver fora da faixa aceitável, faz-se necessário implantar
ação corretiva3
• Sempre que um novo agente antimicrobiano for acrescentado ou houver
mudanças importantes no método de leitura dos resultados dos testes
(ex.conversão de leitura visual da CIM para leitura instrumental ou
mudança no tipo de painel usado), estes devem ser realizados por cinco
dias consecutivos e documentados, antes de se passar para uma freqüência
mensal.
4.2. FreQüêNCIa doS TeSTeS de CoNTroLe de QuaLIdade Para TeSTeS de TrIageM
• Testes em placas para triagem de resistência a vancomicina e de
resistência de alto-nível de aminoglicosídeos podem ser realizados no
mínimo mensalmente, desde que o laboratório realize os testes
rotineiramente e os critérios de mudança do sistema de teste de diário
para mensal tenham sido atingidos.
• Se o teste de triagem não for realizado rotineiramente (< que
uma vez/semana) ou se o agente antimicrobiano for lábil (ex.
ampicilinas, meticilinas, imipenem, ácido clavulânico, ceflacor e
cefamandole), será necessária a realização de testes de controle de
qualidade sempre que o teste de triagem for realizado em amostras
clínicas.
4.3. TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade do MeIo de CuLTura
4.4. MéTodo de dILuIção eM Ágar8
• Os meios indicados para os testes de diluição em Ágar são: Ágar
Müeller-Hinton ou Ágar Müeller-Hinton com sangue lisado de cavalo ou
sangue desfibrinado de carneiro a 5%.
a)esterilidade
• Após preparo das placas, examinar uma amostra significativa de cada
lote (10%) para confirmar sua esterilidade, mediante sua incubação a
30°C-35°C, por pelo menos 24 horas.
As placas devem ser usadas até sete dias após o preparo, a não ser
que sejam tomadas precauções adequadas, como embrulhá-las em saco
plástico e protegê-las da luz quando o antimicrobiano é fotossensível.
B) pH
• O pH de cada lote de placas de Ágar Müeller-Hinton ou Ágar
Müeller-Hinton com sangue lisado de cavalo ou sangue desfibrinado de
carneiro a 5% deve ser verificado quando o ágar for preparado. O meio
ágar deverá ter pH entre 7,2 e 7,4 à temperatura ambiente após
solidificação.
•A medida do pH deve ser feita preferencialmente através de pHmetro
apropriado, submerso em porção de meio solidificado à temperatura
ambiente. Caso esteja fora das especificações, deve-se checar a
procedência do meio, a qualidade da água e, eventualmente, preparar
novo lote, seguindo-se estritamente as recomendações do fabricante.
•Métodos de verificação de pH – ver CLSI Norma M7-A7 ou norma substituta.
4.5. MéTodo de dILuIção eM CaLdo (MICrodILuIção e MaCrodILuIção) 8
• O meio indicado para os testes de diluição em caldo é Müeller-Hinton.
a)esterilidade
•Após preparo do meio, examinar uma amostra significativa e aleatória
(10%) de cada lote para confirmar sua esterilidade, mediante sua
incubação a 30°C-35°C por, pelo menos, 24 horas.
B) pH
• O pH de cada lote de caldo Müeller-Hinton deve ser verificado quando o meio for preparado.
O meio deverá ter pH entre 7,2 e 7,4 à temperatura ambiente.
C) efeitos da timidina ou timina
•Para determinar a adequação do meio para testes de sulfonamida e
trimetropim, os testes de CIM podem ser realizados com E. faecalis ATCC
29212.
Os pontos finais devem ser de fácil leitura (com uma redução de 80%
ou mais no crescimento, quando comparado com o controle). Se a CIM para
trimetoprim-sulfametoxadol for = 0,5/0,95µg/mL, o meio poderá ser
considerado apropriado para uso.
Os testes dilucionais para monitorar a acurácia dos resultados devem
ser realizados com os Antimicrobianos que fazem parte do antibiograma
liberado pelo laboratório. Para cada gênero ou espécie de bactérias ou
classe de antimicrobiano são recomendadas cepas de referência
específicas.
Os limites aceitáveis para as concentrações CIM (µg/mL) definidos
para as cepas de referências e os diversos antimicrobianos são descritos
– em CLSI norma M100-S16 ou norma substituta.
4.6. TeSTeS de QuaLIdade da ProVa e do PerFIL de SeNSIBILIdade
a) Condições dos testes e cepas de controle de qualidade usadas para monitorar a acurácia dos testes de CIM (µg/mL).
enterobactérias
•Meio
.Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions
.Diluição em ágar: Ágar Müeller-Hinton
Implantação da Rede Nacional de Monitoramento da Resistência Microbiana em Serviços de Saúde
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas
•Cepas de referência: E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218 (para combinações ß-lactâmicos/ inibidor de ß-lactamase)
Detecção de eSbl em K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli e P. mirabilis
Testes de triagem de eSbl K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli
•Meio: Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions
•Concentração de Antimicrobianos:
.Cefpodoxima 4µg/mL ou
. Ceftazidima 1µg/mL ou
. Aztreonam 1µg/mL ou
. Cefotaxima 1µg/mL ou
. Ceftriazona 1µg/mL
• Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5 de McFarland.
• Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas
• Cepas de referência: E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603
Testes de triagem de eSbl P. mirabilis
•Meio: Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions
•Concentração de Antimicrobianos:
.Cefpodoxima 1µg/mL ou
.Ceftazidima 1µg/mL ou
. Cefotaxima 1µg/mL ou
• Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas
•Cepas de referência: E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603
Teste confirmatório de ESBL
• Meio: Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions
• Concentração de Antimicrobianos:
. Ceftazidima 0,25 -128µg/mL
. Ceftazidima/ácido clavulanico 0,25/4 -128/4µg/mL
.Cefotaxima 0,25 -64µg/mL
. Cefotaxima/ácido clavulanico 0,25/4 -64/4µg/mL
• Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5 de McFarland.
• Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas
• Cepas de referência: E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603
P. aeruginosa e outros não-enterobacteriaceas (inclue Pseudomonas spp., e outros bacilos grannegativos
não fastidiosos e não fermentadores exceto B. cepacia, B. mallei, B. pseudomallei, S.
maltophilia e Acinetobacter spp.)
•Meio
. Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions
. Diluição em ágar: Ágar Müeller-Hinton
• Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5 de McFarland.
• Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 16 a 20 horas
• Cepas de referência: P. aeruginosa ATCC 27853; E. coli ATCC 25922,
E. coli ATCC 35218 (para combinações ß-lactâmicos/inibidor de
ß-lactamase)
Acinetobacter spp., Burkodelia cepacia, S. maltophilia
•Meio
.Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions
.Diluição em ágar: Ágar Müeller-Hinton
•Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 35oC ± 2 graus, ar ambiente, de 20 a 24 horas
•Cepas de referência: P. aeruginosa ATCC 27853; E. coli ATCC 25922,
E. coli ATCC 35218 (para combinações ß-lactâmicos/inibidor de
ß-lactamase)
Staphylococcus spp.
•Meio
.Diluição em caldo:
Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions + NaCl a 2% para
oxacilina, meticilina e nafcilina; Caldo Müeller-Hinton ajustado com
cátions suplementado
com 50µg/mL de cálcio para daptomicina.
.Diluição em ágar: Ágar Müeller-Hinton, Ágar Müeller-Hinton +NaCl a
2% para oxacilina, meticilina e nafcilina. Diluição em ágar não é
recomendada atualmente
para daptomicina.
•Inóculo: Método de suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5 de McFarland.
•Incubação: 33 - 35oC, ar ambiente, de 16 a 20 horas, 24 horas para oxacilina, meticilina, nafcilina e vancomicina
•Cepas de referência: S. aureus ATCC 29213; E. coli ATCC 35218 (para
combinações ß-lactâmicos/inibidor de ß-lactamase); S. aureus ATCC
BAA-977 e/ou BAA-976 (teste de indução à clindamicina)
Teste de triagem com ágar Oxacilina – NaCl para S. aureus
• Meio: Diluição em ágar:
Ágar Müeller-Hinton + NaCl a 4% m/v e 6µg/mL de oxacilina.
• Inóculo: Método de suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5
de McFarland.
• Incubação: 35oC, ar ambiente, 24 horas.
• Cepas de referência: E. faecalis ATCC 29212 – sensível, E. faecalis ATCC 51299 -resistente.
Teste de triagem com ágar Vancomicina para S. aureus
• Meio: Diluição em ágar:
Ágar BHI e 6µg/mL de vancomicina.
• Inóculo: Método de suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5
de McFarland.
• Incubação: 35oC, ar ambiente, 24 horas.
• Cepas de referência: S. aureus ATCC 29213 – sensível, S. aureus ATCC 43300 - resistente
Enterococcus spp.
•Meio
. Diluição em caldo: Caldo Müeller-Hinton ajustado com cátions ou
Caldo Müeller- Hinton ajustado com cátions suplementado com 50µg/mL de
cálcio para daptomicina.
. Diluição em ágar: Ágar Müeller-Hinton. Diluição em ágar não é recomendada atualmente para daptomicina.
• Inóculo: Método de crescimento e suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução padrão 0.5 de McFarland.
• Incubação: 35oC ± 2 graus ar ambiente, de 16 a 20 horas, 24 horas para vancomicina.
• Cepas de referência: E. faecalis ATCC 29212
Teste de triagem para alto nível de resistência a aminoglicosídeos e
resistência a vancomicina para Enterococcus spp. Tabela 2D – M100-S16
•Meio
.Diluição em ágar: Ágar BHI
.Antimicrobianos:
–6µg/mL de vancomicina ou
– 2000µg/mL de estreptomicina ou
– 500µg/mL de gentamicina.
. Diluição em caldo: meio BHI
. Antimicrobianos:
– 1000µg/mL de estreptomicina ou
– 500µg/mL de gentamicina.
• Inóculo: Método de crescimento ou suspensão direta das colônias, equivalente a uma solução
padrão 0.5 de McFarland.
. Ágar: colocar 10 µL da suspensão 0,5 de McFarland na superfície da placa
• Incubação: 35oC, ar ambiente, 24 horas.
• Cepas de referência: E. faecalis ATCC 29212 -sensível, E. faecalis ATCC 51299 -resistente.
Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Leveduras
O CIQ tem como objetivo monitorar os seguintes aspectos:
• precisão (repetitividade) e acurácia (exatidão) dos resultados obtidos nos testes de sensibilidade;
• desempenho dos reagentes utilizados nos testes; e
• desempenho dos técnicos que executam os testes e realizam a leitura dos resultados.
Esse objetivo é mais facilmente atingido, com uso de cepas de
referência que têm sua sensibilidade aos antifúngicos pré-determinada.
No entanto, isso não dispensa a adoção de outras medidas que melhoram a
qualidade dos resultados.
1. CePaS de reFerêNCIa9,10
1.1. CePaS reCoMeNdadaS Para TeSTeS de CIM de 48 HoraS Por dILuIção eM CaLdo
Faixa de leitura CIM: Ver tabela 4- M27-A2 ou norma substituta.
Candida parapsilosis ATCC 22019.
Candida krusei ATCC 6258.
1.2. CePaS reCoMeNdadaS Para TeSTeS de CIM de 24 e 48 HoraS Por MICrodILuIção eM CaLdo
Faixa de leitura CIM: Ver tabela 5- M27-A2 ou norma substituta.
Candida parapsilosis ATCC 22019.
Candida krusei ATCC 6258.
1.3. CePaS reCoMeNdadaS Para dISCo-dIFuSão
Candida parapsilosis ATCC 22019 – Intervalo de valores do halo de
inibição (diâmetro em mm), esperado em testes com discos de fluconazol
(25 mg) -22-33mm.
Candida albicans ATCC 90028 – Intervalo de valores do halo de
inibição (diâmetro em mm), esperado em testes com discos de fluconazol
(25 mg) -28-39 mm.
Candida tropicalis ATCC 750 – Intervalo de valores do halo de
inibição (diâmetro em mm), esperado em testes com discos de fluconazol
(25 mg)-26-37mm.
2. MaNuSeIo e eSToCageM daS CePaS de reFerêNCIa
2.1. PreParo daS CePaS de reFerêNCIa Para arMazeNaMeNTo
• As suspensões-padrão, preparadas de acordo com o procedimento
delineado a seguir, podem ser mantidas indefinidamente, sem risco
significativo de alteração nos perfis de sensibilidade ao agente
antifúngico.
• Para preparar as cepas para armazenamento, deve-se obedecer ao procedimento abaixo:
.Cultivar os organismos em placas de Petri, durante uma noite, em
ágar Sabouraud-dextrose, ou em ágar batata-dextrose, ou ágar enriquecido
com digerido de
soja-caseína.
.Selecionar várias colônias e realizar testes de sensibilidade
apropriados, para demonstrar resultados esperados de sensibilidade, halo
de inibição no método de
disco-difusão ou CIM na macrodiluição ou microdiluição (ver item
anterior para halos de referência ou Tabelas 4 e 5 do doc. M27A2 ou
norma substituta para valores esperados de CIM).
.Realizar uma subcultura das cepas, que produziram os resultados
esperados, no mesmo meio usado para a cultura primária e incubar para
que ocorra crescimento suficiente (em geral, de um a três dias).
.Examinar, com cuidado, a morfologia e cor das colônias para se certificar da pureza da cultura.
. Suspender as colônias na solução estabilizante de glicerol a 50%,
até fazer suspensão densa ou, se estiver liofilizado, suspender no meio
apropriado.
.Distribuir pequenos volumes (uma ou duas gotas) da suspensão turva em recipientes estéreis recomendados para congelamento.
.Colocar esses recipientes em freezer (preferencialmente à – 60oC ou -20oC ) ou em nitrogênio líquido.
.Quando o estoque de recipientes estiver praticamente exaurido, repete-se o processo para produzir um novo estoque.
2.2. arMazeNaMeNTo daS CePaS de reFerêNCIa
•Para o armazenamento prolongado das cepas de referência. As
leveduras devem ser cultivadas em ágar batata-dextrose e depois
congeladas a -70oC. Alternativamente, as cepas de referência (não
Criptococcus) podem ser cultivadas suspendendo as células fúngicas
em solução de glicerol a 50% em pequenos frascos e armazenados a -70oC.
•Para armazenamento de curto prazo, as culturas-padrão de trabalho,
ou seja, de uso rotineiro nos tstes, devem ser cultivadas a 35°C (+ 2°C)
em tubos de ágar-Sabouraud ou ágar sangue, em tubos inclinados, até se
observar crescimento suficiente, sendo depois armazenadas à temperatura
de 2 a 8oC, enquanto não são utilizadas nos testes.
2.3. MaNuSeIo daS CePaS de reFerêNCIa NoS TeSTeS de roTINa
• Todas as culturas usadas em testes de sensibilidade a antifúngicos
devem ser semeadas em meio isentos de antibióticos, antes de serem
submetidas às análises.
• As cepas de controle de qualidade devem ser testadas usando os
mesmos materiais e métodos empregados para testes de isolados clínicos.
Para o uso das cepas de referência nos testes de rotina, é necessário realizar os seguintes procedimentos:
•Retirar o recipiente da cultura do freezer ou frasco liofilizado.
• Deixar descongelar a suspensão congelada ou reidratar a cultura liofilizada.
• Realizar uma subcultura, bem distribuída, em placa de Petri, contendo ágar batata-dextrose
e incubá-la a 35° C (+ 2°C) durante 24 horas.
• Retirar quatro ou cinco colônias, realizar subcultura em ágar Sabouraud-dextrose ou ágar
batata-dextrose e, após 24h, realizar testes de sensibilidade.
• As cepas-padrão, após seu crescimento a 35°C (+ 2°C) por 24 horas em ágar-batata-dextrose,
devem ser mantidas em geladeira, sob temperatura entre 2 a 8°C, como “cultura-padrão
de trabalho” para uso na rotina. Essas culturas devem ser substituídas de duas em duas
semanas, pelo menos, por outras do estoque congelado.
•Realizar sempre os testes de sensibilidade das colônias cultivadas durante uma noite.
•Os repiques das culturas de trabalho são preparados a cada duas semanas pelo método de
transferência seriada.
•A cada três repiques da cultura de trabalho, deve-se descongelar uma
nova amostra para uso em testes de rotina, para diminuir o risco de
contaminação.
• Deve-se obter uma cultura de trabalho nova sempre que ocorrerem resultados aberrantes.
3. FreQüêNCIa doS TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade
3.1. INTerVaLoS de CIM
As Tabelas 4 e 5 (CLSI M27-A2 ou norma substituta) apresentam os
intervalos de precisão dos valores de CIM para um único teste de
controle.
Em geral, um dentre 20 valores de CIM, em série de 20 testes
consecutivos, pode estar fora do controle (i.e., fora da faixa
definida), devido às variações aleatórias do teste.
Dois resultados consecutivos, com valores fora do esperado ou mais de
dois resultados fora do esperado em 20 testes de controle consecutivos,
exigem medidas corretivas. Toda vez que se tomar medidas corretivas, a
contagem de 20 testes consecutivos recomeça.
OBS.: Não confundir esse procedimento com o procedimento para
estabelecer o desempenho satisfatório dos testes de CIM visando à
realização de testes de controle da qualidade mensais, ao invés de
diários.
3.2. TeSTeS de SeNSIBILIdade a aNTIFúNgICoS
Para monitorar o desempenho geral dos procedimentos para testes,
recomenda-se incluir cepas de referência apropriadas, todo dia que o
teste for realizado.
Esse procedimento é apenas para estabelecer o desempenho satisfatório
dos testes de CIM e disco-difusão, com a finalidade de realizar testes
de controle da qualidade mensais, ao invés de diários. Esse procedimento
não deve ser confundido com os passos que devem ser seguidos para tomar
as medidas de correção.
A freqüência do monitoramento dos testes pode ser diminuída se o
laboratório puder documentar desempenho satisfatório com testes de
controle diários. Para esse fim, define-se desempenho satisfatório da
seguinte maneira:
• documentação que comprove que todas as cepas de referência foram
testadas durante cinco dias consecutivos de testes; e Tecnologia em
Serviços de Saúde
•para cada combinação droga-microrganismo, nenhum dos cinco valores
de CIM (i.e., valores de CIM obtidos para uma combinação
droga-microrganismo durante cinco dias consecutivos de testes) ou
diâmetros dos halos de inibição podem estar fora do intervalo de
acurácia definidos nas Tabelas
4e 5 em CLSI M27-A2 ou norma substituta e item cepas de referência para leveduras.
Quando essas condições forem cumpridas, será preciso testar cada cepa
de referência pelo menos uma vez por mês2,6 e sempre que qualquer
reagente ou artigo plástico for mudado.
Sempre que for constatado um valor de CIM ou diâmetro de halo fora do
intervalo de acurácia, usando o sistema de monitoramento mensal, será
necessário recomeçar e manter os testes de controle diários enquanto não
se definir qual é a fonte de erro para o resultado aberrante e a
resolução do problema não tiver sido documentada da seguinte maneira:
• realizar os testes com cepas de referência apropriadas durante cinco dias consecutivos;
• para cada combinação droga-microrganismo, os cinco valores de CIM
(ex., valores de CIM obtidos para uma combinação droga-microrganismo
durante cinco dias consecutivos de testes) devem se manter dentro do
intervalo de acurácia definidos nas Tabelas 4 e 5
(CLSI M27-A2);
• se a solução do problema não puder ser documentada (ex., pelo menos
um dos cinco valores de CIM ou diâmetro do halo de inibição estiver
fora do intervalo de acurácia) será necessário continuar os testes
diários de controle da qualidade;
• o retorno à adoção de testes mensais exige documentação do
desempenho satisfatório durante cinco dias consecutivos, conforme já
descrito;
• no caso de algumas drogas, os testes de controle de qualidade devem
ser efetuados com freqüência maior do que uma vez por mês, devido à
degradação relativamente rápida da droga.
4.TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade doMeIo de CuLTura e arTIgoS de PLÁSTICo9
Para controle de lotes de meio de cultura e de artigos plásticos, o procedimento pode ser dividido nos passos abaixo.
• Testar cada novo lote de meio usado em tubos de macrodiluição, ou
lote de placas de microdiluição, usando uma das cepas-controle da
qualidade relacionadas na Tabela 4 CLSI
M27-A2 ou norma substituta para determinar se os valores de CIM estão
dentro do intervalo esperado; caso contrário, rejeitar o lote.
• Pelo menos um tubo de cada lote deve ser incubado, sem inocular,
durante o mesmo período necessário para realizar o teste, de maneira a
se verificar a esterilidade do meio.
• Os lotes novos do meio RPMI-1640 devem ser testados para verificar
se seu desempenho será aceitável, antes de usá-los em testes de isolados
clínicos, visto que estudos recentes demonstram que alguns lotes não
têm desempenho apropriado. O pH do meio RPMI-1640 pode variar de 6,9 a
7,1 e o pH do meio Müeller-Hinton deve ficar entre 7,2 e 7,4.
• Registrar os números de lote de todos os materiais e reagentes usados nesses testes.
5.ouTroS TeSTeS de CoNTroLe uTILIzadoS
Na MaCrodILuIção e MICrodILuIção
5.1. CoNTroLe do CreSCIMeNTo
Cada série de tubos na macrodiluição deve incluir um controle de
crescimento do meio RPMI 1640, sem agente antifúngico, para avaliar a
viabilidade das leveduras em teste. Na microdiluição uma coluna da placa
de micro titulação é destinada a esse controle. Em testes de caldo, o
controle do crescimento também serve como controle da turbidez para a
leitura dos pontos finais de reação.
5.2. CoNTroLe de Pureza
Uma alíquota de cada inóculo deve ser colocada numa placa de ágar
Sabouraud-dextrose e in cubada à temperatura de 35°C + 2°C até haver
crescimento suficiente para detectar possíveis culturas mistas e prover
novas colônias isoladas para o caso de se tornar necessário repetição do
teste.
5.3. CoNTroLe da LeITura doS PoNToS FINaIS da reação
Aleitura dos pontos finais da reação deve ser monitorada,
periodicamente, para minimizar possíveis variações nos resultados de
testes de CIM, realizados por diferentes observadores. Todo pessoal de
laboratório que realiza esses testes deverá ler, separadamente, um
conjunto selecionado de testes de
diluição. Os resultados devem ser registrados e comparados com os
resultados obtidos por um técnico experiente. As cepas de referência,
com valores de CIM pré-determinados, são particularmente úteis para essa
finalidade, especialmente, em testes com fluconazol, em que pode
ocorrer o fenômeno de trailing.
6.TeSTe da QuaLIdade da ProVa e do PerFIL de SeNSIBILIdade
a) Condições dos testes e cepas de controle da qualidade usadas para monitorar a acurácia dos testes de CIM (µg/mL)
•Meio: Diluição em caldo: Meio RPMI -1640 (com glutamina, sem bicarbonato e com indicador vermelho fenol) pH 7,0 ± 0,1.
•Inóculo: As diferentes operações de preparo do inóculo são as abaixo.
.Deve-se realizar a subcultura (repique) dos organismos, em tubos
estéreis com ágar Sabouraud dextrose ou ágar batata-dextrose, executando
passagens para assegurar sua pureza e viabilidade.
.O inóculo deve ser preparado escolhendo-se cinco colônias com
diâmetro de ~1mm de cultura de 24 horas para espécies de As colônias
devem ser suspensas em 5mL de solução salina estéril 0,145 mol/L (8,5g/L
NaCl; salina a 0,85%).
.A suspensão resultante deve ser colocada em agitador de vórtex
durante 15 segundos e a densidade celular, ajustada com
espectrofotômetro, acrescentando-se solução salina suficiente para obter
a transmitância equivalente de uma solução-padrão da escala 0,5 de
McFarland em comprimento de onda de 530nm. Esse procedimento fornece uma
suspensão-padrão de levedura contendo 1 x 106 a 5 x 106 células por mL A
suspensão de trabalho é produzida fazendo-
se uma diluição 1:100 seguida de uma diluição de 1:20 da
suspensão-padrão com meio líquido RPMI 1640, resultando em concentração
de 5,0 x 102 a 2,5 x 103 células por mL.
•Incubação:
A temperatura de incubação deve permanecer em 35° C. Tecnologia em Serviços de Saúde
Controle da qualidade em testes de sensibilidade realizado por Métodos Automatizados
1. eLeMeNToS eSSeNCIaIS do SISTeMa de geSTão da QuaLIdade
1.1. FaSe Pré-aNaLíTICa
a) representante/empresa responsável pelo equipamento
•Manual de funcionamento do equipamento no idioma do país.
•Registro nacional e certificado de funcionamento in situ do equipamento e de qualidade dos lotes dos reagentes.
• Plano de manutenção preventiva e corretiva do equipamento.
• Programa de capacitação para o uso apropriado do equipamento.
• Fornecimento de cepas ATCC para o controle interno de qualidade de acordo com as especificações do equipamento.
•Atualização do software a cada mudança.
• Comunicação escrita dos problemas registrados que impliquem em mudança da qualidade dos resultados.
B) usuário
• Manual de procedimento do laboratório para o uso do sistema automatizado.
• Capacitação de pessoal no uso do equipamento.
• Programa de manutenção preventiva e corretiva do equipamento.
• Notificação, à autoridade competente, de forma escrita, dos problemas
registrados que impliquem em mudanças na qualidade dos resultados obtidos.
1.2. CoNTroLe INTerNo do LaBoraTórIo
a) Controle de temperatura
•Registro diário da temperatura ambiental.
•Registro diário da temperatura interna do equipamento.
•Registro de alertas do equipamento.
•Registro das medidas corretivas tomadas.
B) Preparo e padronização do inóculo
• Se for utilizado turbidimetro, deve-se calibrar e registrar diariamente transmitância.
• Definir e registrar a forma e a freqüência do controle de esterilidade da solução de trabalho.
1.3. CoNTroLe da QuaLIdade doS ProCeSSoS auToMaTIzadoS
A) Lista de cepas de referência recomendadas para testes de identificação
Recomenda-se testar no mínimo uma cepa de referência por painel.
Para painéis de gram negativos:
• E. coli 25922 (qualidade da prova).
• P. mirabilis 7002 (qualidade da prova de identificação de bacilos Gram-).
• K. pneumoniae 13883 (qualidade da prova de identificação de bacilos Gram-). Para painéis de gram positivos:
• S. aureus 29213 (qualidade da prova de identificação de bacilos Gram+).
• E. faecalis 29212 (qualidade da prova de identificação de bacilos Gram+). Para painéis de levaduras:
•C. albicans 14053 (qualidade da prova de identificação de levaduras).
B) Lista de cepas de referência recomendadas para testes de sensibilidade
Para painéis de gram negativos:
•E. coli 25922 (qualidade da prova).
•E. coli 35218 (para inibidores de ß lactamase).
• E. coli 51446 (ESBL).
• P. aeruginosa 27853 (concentração de cátions e pH com aminoglicosídeos).
• E. faecalis 29212 (quantidade de timina-timidina com SXT).
Para painéis de gram positivos:
• S. aureus 29213 (qualidade da prova).
• E. faecalis 29212 (quantidade de timina-timidina com SXT).
• E. faecalis 51299 (resistência a vancomicina).
• E. coli 35218 (para inibidores de ß lactamase).
1.4. VaLIdação
a) Protocolo de controle da qualidade diário
Prova diária por 5 dias
•Sem erro, seguir com o controle periódico.
•= 1de cada 5 ensaios apresentarem erro, tomar ações corretivas:
. erro óbvio6: testar novamente no mesmo dia e, se o resultado for o esperado, continuar com as provas diária.
. erro não óbvio6: testar novamente no mesmo dia e controlar por cinco dias consecutivos.
Se todos os resultados estiverem dentro do esperado, passar ao controle mensal.
B)Protocolo de controle da qualidade periódico
• Recomenda-se realizar os controles a cada mês, utilizando as listas
de cepas de referência acima mencionadas. Também deve ser realizado um
controle a cada troca de lote do painel.
• Se os testes mensais apresentarem erros, tomar ações corretivas e retornar aos testes
de CIQ diários.
Referências
Bibliográficas
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MICROBIOLOGY. http://w3.whosea.org/EN/Section10/Section17/Section53/Section482_
1790.htm
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6.NCCLS/CLSI -Padronização dos Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos por Disco—difusão:
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M2-A8. Vol. 23 Nº 1
7.NCCLS/CLSI -Normas de Desempenho para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana: 16o
Suplemento Informativo. Documento M100—S16. Vol. 26 Nº 3 - Substitui a Norma M100-S15
Vol. 25 Nº 1.
8.NCCLS/CLSI -Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluição
paa Bactéria de Crescimento Aeróbico: Norma Aprovada – Sexta Edição. Documento M7—A7.
Vol. 26 Nº 2. Substitui a Norma M7-A6 Vol. 23 Nº 2.
9.NCCLS/CLSI - Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para Determinação da
Sensibilidade de Leveduras à Terapia Antifúngica: Norma Aprovada – Segunda Edição. Documento
M27-A2 Vol. 22 Nº 15 — Substitui a Norma M27-A. Vol. 17 Nº 9
10.NCCLS/CLSI -Method for Antifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing of Yeasts; Approved
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11.Programa de Acreditação de Laboratórios Clínicos – PALC. Lista de requisitos PALC. Sociedade
Brasileira de Patologia Clínica/ Medicina Laboratorial (SBPC/ML), 2004. http://www.sbpc.
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12.RelatóriofinaldeComitédeExpertosenlaevaluacióndeldesempeñoparalaidentificaciónbacteriana
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13.Reimer, LG and Carrol, K.C. Procedures for Storage of Microorganisms. In: Manual of Clinical
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aNexO i: ProCedIMeNToS uTILIzadoS Para MaNuTeNção
e eSToCageM de MICrorgaNISMoS
Link dessa matéria com ilustracões: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/manual_testes_antimicrobianos.pdf
